生物天地

（1）在配制溶液前，请先计算所配试剂中各成分的用量。

⑴ 可能是因为反应体系内无ATP或Mg2+导致连接失败，解决方案：使用随酶提供的buffer或向其它兼容的buffer中加入ATP。含ATP的Buffer保存超过1年，其内ATP可能会降解，导致连接失败。当补加ATP时，确定补加的是核糖核酸ATP，而不是脱氧核糖核酸ATP，因为后者不起作用；

 

A）检查感受态细胞是否有问题，不管公司的也好自己做的也好，转化连接产物时同时转化一只质粒，作为对照。

B）连接T的时候,保证连接比例没有问题。连接时间可以适当延长，但是试剂盒的连接往往效率很高，连接时间不是大问题。

C）转化的细节处理：加培养基复苏：摇1h的话，可以多加入一些培养基，此时培养基一定不要加入抗性！摇1h复苏，摇速在150rpm先摇30min。

D)涂板时来回轻轻涂布，感觉大多数地方都涂到即可,不要反复用力涂布,不要把涂布环或者涂布棒烧的过热,或者不待冷却就涂。切记感受态细胞比较娇嫩。

E）检查一下琼脂板是否有问题。

F）检查一下抗生素在配置过程中是否出错，有没有加错。

有两种解决方法：（1）把阻遏蛋白lacⅠ的温度敏感突变株lacⅠ(ts)插入表达载体或整合到染色体后，均能使lac、tac启动子的转录受到温度严谨调控，在较低温度（30℃）时抑制，在较高温度（42℃）时开放；（2）用乳糖替代IPTG，但其效率受到多种因素的影响和制约，因此乳糖诱导的有效剂量大大高于IPTG。乳糖本身作为一种碳源可以被大肠杆菌代谢利用，较多的乳糖存在也会导致菌体生理及生长特性变化。乳糖代替IPTG作为诱导剂的研究要与发酵工艺结合起来，才能显示其良好的前景。

      A）细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。DH5α菌株OD600为0.5时细胞密度是5×107/ml）；

  （1）插入片断和载体片断的比例要高。
（2）连接酶要加的多点，最好用高浓度的酶。

（1）连接反应的温度：ＤＮＡ连接酶的最适反应温度为３７℃，但在此温度下，粘性末端的氢键结合很不稳定，折衷方法是１２℃过夜。
（2）DNA的平未端和粘性末端：由于内切酶产生的DNA末端有平未端和粘性末端，因而连接反应中就有平未端连接和粘性末端连接。二者连接效率不同。粘性末端效率高，因而在底物浓度，酶浓度选择上是有差异的。

（1）连接缓冲液活性低，ATP降解或缓冲液稀释不当

对策：使用一次性分装的缓冲液，避免反复冻融。提供的T4连接酶缓冲液为十倍浓度，正确稀释。

（2）连接酶失活 对策：更换连接酶